Son Akşam Yemeği, İsa’nın Kudüs'te Romalı askerlerce yakalanıp çarmıha gerilmesinden önce havarileri ile yediği son akşam yemeğini konu alır. İsa, uzunca bir yemek masasının ortasında konuşlanmış, her iki yanında ise 12 havarisi yer almaktadır. Eser, İsa’nın havarilerine içlerinden birinin ona ihanet edeceğini açıkladığı dramatik anı yansıtmaktadır. Bu şok edici açıklamanın etkisi ile havariler farklı tepkiler vermektedirler. Bu duygusal olarak yüklü atmosfere rağmen, İsa, resmin tam ortasında huzur ve sükunetini korur halde durmaktadır. İsa, ortamdan ve havarilerin tepkilerinden izole olmuş duruşuyla eserin ana karakteri olduğunu açıkça vurgularken, havariler de tepkileri ile üçlü gruplara ayrılırlar.
Sol baştaki üçlü - Bartalmay (Bartholomew), Alfay'in oğlu Küçük Yakup (James, son of Alpheus), ve Andreas (Andrew) - olay karşısında şaşkındırlar ve sorgulayıcı tavırlar sergilerler. Ellerini hayret içinde kaldırmış Andreas, İsa'yi işaret ederek onunla konuşan Yakup ve masadan heyecanla kalkmış olan Bartalmay eserdeki şok hissini pekiştirir.
Masanın diğer ucundaki üçlü'den Matta (Matthew) ve Yehuda Taday (Jude Thaddeus) masanın sağ başında oturan Simun'a (Simon) dönmüş, İsa'yı işaret ederek sorularına yanıt aramakta, durumu tartışmaktadırlar. Bu üçlü ile İsa arasında kalan diğer üçlü grubu Tomas (Thomas), Büyük Yakup (James, son of Zebedee) ve Filipus'tan (Philippe) oluşur. Bu üçlü farklı biçimlerde İsa'ya dönmüş ve açıklama beklemektedirler. Parmağını kaldırmış Tomas, kollarını açmış Yakup ve elleri göğsünde İsa'ya seslenen Filipus, bir ihanetin nasıl söz konusu olabileceğini anlamaya
çalışmaktadır.
İsa'nın resme göre hemen solunda yer alan üçlü grup Petrus (Peter), Yahuda (Judas) ve Yahya'dan (John the Evangelist) oluşur ve eserdeki en can alıcı karakterleri barındır. Üçlünün içinde en dikkat çekici figür, ortadaki Yahuda, yani İsa'ya ihanet etmiş olan havarisidir. Yahuda sırrının açığa çıkmış olmasından dolayı korkmuş ve geri çekilmiştir. Yahuda sağ elinde bir kese tutmaktadır. Bu kese Yahuda'nin İsa’nın kimliğini Romalılar’a ifşa etme karşılığında almış olduğu gümüş sikkeleri içermektedir. Yahuda’nın sol elinin önündeki tabağa uzandığı görülür. Aynı tabağa İsa da uzanmaktadır. Bu hareket İsa’nın havarilerinin "Kim ihanet edecek?" sorusuna verdiği yanıta bir referanstır. Yüzü karanlık içinde olan Yahuda'nin başı da havariler arasında en düşük seviyededir ve "ihanet eden" kimliğini seyirciye vurgular. Yahuda’nın hemen ardında yer alan beyaz saçlı-sakallı Petrus, arkadaki elinde bir bıçak tutmaktadır. Petrus, Romalı askerler İsa’yı yakaladıklarında askerlerden birinin kulağını kesecektir. Dolayısıyla eserde de bıçakla bu olaya bir gönderme yapılmıştır. Yahuda ile İsa arasında yer alan Yahya, İsa’nın en genç havarisidir. İncilde İsa’nın en sevdiği havarisi" olarak adı geçen Yahya, korkunç açıklamanın etkisi ile kendinden geçmis halde Petrus'a doğru yaslanmıştır. Yeni ergen bir oğlan görünümünde betimlenen Yahya, sanat eserlerinde uzun sarı-kızıl saçları ile oldukça kadınsı bir görünümde resmedilir. Leonardo'nun da kimliğini belirginleştirmek için Yahya'yı benzer biçimde betimlediği görülür.
Açıklanan ihanet üzerine telaş içinde birbirine karışmış havarilere oldukça zıt bir görünümde olan İsa, masanın tam ortasında huzurlu duruşunu korumaktadır. İsa'nın sol eli ile işaret ettiği ekmekten aynı zamanda Efkaristiya (Eucharist) denen ekmek-şarap ritüelinin temelini de açıklamakta olduğu anlaşılır. Ölümünden sonra kendisini anmaları için havarilerine şarabı kendi kanı, ekmeği de bedeni olarak tüketmelerini belirten İsa, yemek masasında ihanetle birlikte aynı zamanda bu ritüeli açıklarken betimlenmiştir.
Resim Hristiyanlık kutsal üçlemesine (baba-oğul-kutsal ruh) birçok noktada gönderme yapmaktadır. Arka plandaki pencereler, tavandaki kirişler üçlü gruplar halinde yer alırken, havariler de üçlù üçlü gruplanmış, İsa ise duruşu itibari ile bir üçgen şekli çizmektedir.
Leonardo'nun eserini çarpıcı kılan noktalardan biri sıra dışı ve etkili perspektif kullanımıdır. Santa Maria delle Grazie Manastırının iç duvarında yer alan resim bu perspektif kullanımı ile duvardan içeri giren ayrı bir oda varmış gibi bir göz yanılması yaratmaktadir. Bunun yanısıra muhteşem teknik aynı zamanda resmin doğallığını da gözler önüne sermektedir.
Bir duvar resmi olmasına rağmen Leonardo'nun ıslak kireç üzerine boyanmış bir fresk değidir. Taş duvarın üzerine kendi geliştirdiği farklı bir yöntemle boyamayı seçen Leonardo, daha canlı renkler elde etmeyi amaçlamış olsa da sonuç maalesef başarısız olmustur. İlk 50 yıl içinde bile yüzeyinin ciddi bir kısmını yitiren eser, ikinci dünya savaşı sırasında bulunduğu manastırın bombalaması da dahil olmak üzere birçok farkli şekilde yıpranmaya maruz kalmıştır. Günümüzde restorasyon çabaları ile korunan eser Leonardo'nun özgün fırça darbelerinin büyük kısmını yitirmiştir. Resmin özgün halinde masadaki tabakların, havarilerin giysilerinin renklerini yansıttığı bilinmektedir. Günümüzde yıpranmış durumundan dolayi eserin birçok ayrintisi gözlemlenememektedir. Resmin ortasına sonradan açılan kapı nedeni ile İsa'nın ayakları görünmemektedir. Zamanında görünen ayakların duruşunun çarmıha gerilmiş duruşu sergilediği ve buna işaret etiği düşünülmektedir.